Meine Vorgangsweise, die ich auf Basis einer amerikanischen Publikation modifiziert habe:
- geschlossene Blüte in 25 %iger PEG-Lösung in 70 % Ethanol)
Verweilzeit 24 – 72 h bei Raumtemperatur (RT) - Probenwechsel in 40 %ige PEG-Lösung in Deionat – Dauer ca. 24 h bei RT
- Probenwechsel in 60 %ige PEG-Lösung in Deionat – Dauer ca. 24 h bei RT.
Bei 80 % ist PEG bei RT nicht mehr flüssig, daher vorher aufwärmen – ich verwende dazu einen normalen Dörrautomaten bei 60 °C. Die PEG-Lösung hat ca. 55 – 58 °C.
Das Umbetten der Blüten erfolgt mittels Pinzette – dabei die Lösung soweit wie möglich abtropfen lassen, bevor die Blüte in die nächste Lösung gegeben wird.
- Probenwechsel in 80 %ige PEG-Lösung in Deionat – Dauer ca. 24 h bei 60 °C
- Probenwechsel in 100 % PEG – Dauer ca. 24 h bei 60 °C
- Eingießen in Kunststoffförmchen – ich verwendete in diesem Fall rechteckige Inlets aus einer Pralinenschachtel – Ausrichten der Blüte
- Abkühlen (1 h bei RT)
- Zuschneiden der PEG-Blöckchen, nachdem sie aus der Form entnommen wurden.
Aufbewahrung der Blöckchen in luftdicht verschließbaren Kunststoffbeuteln.
Für das Schneiden spanne ich die PEG-Blöcke direkt, ohne Aufschmelzen auf Holzblöckchen, in den Probenhalter des Mikrotoms.
Das Schneiden erfolgt mit einem Reichert OmE Mikrotom mit selbst aufbereitetem C-Messer.
Die Schnittstärke beträgt 20 µm. Vor dem Schnitt wird auf die Schnittfläche ein Klebeband aufgelegt und mit leichtem Fingerdruck fixiert. Ich verwende dafür Scotch Crystal Clear Tape 600.
Das Klebeband mit dem Schnitt klebe ich auf eine Klarsichtfolie.
Da ich noch keine Methode gefunden habe, die Schnitte zerstörungsfrei auf einen Objektträger zu transferieren, verbleiben die Schnitte auf dem Klebeband.
Das Klebeband mit dem Schnitt wird mit kleiner Schere zugeschnitten und in eine mit Wasser gefüllten Schale transferiert. Dabei wird das PEG aufgelöst und der Schnitt verbleibt auf dem Klebeband. Das Klebeband mit der klaren Seite auf einen Objektträger legen und mit einem Tropfen Färbelösung bedecken. Je nach Färbemethode die entsprechende Färbezeit einhalten.
Danach das Klebeband wieder in eine Wasserschale zum Auswaschen der Farblösung transferieren. Nach W3A Färbung habe ich in 70 % Ethanol differenziert. Danach kurz in 30 % Ethanol abgespült und in Deionat gelegt.
Nachdem ich eine Einbettung des Klebebandes mit dem Schnitt in Eukitt Neo Spezial bislang nicht ohne Luftblasen-Probleme geschafft habe, bette ich in Glyzerin ein und Umrande das Deckglas mit UV-Harz.
Klebeband mit der klaren Unterseite auf Objektträger legen und mit wenig Glyzerin eindecken.
Gerhard Vlcek (www.foto-vision.at)
